Блог

Jun 20, 2023

Слияние частиц супер

Scientific Reports, том 13, номер статьи: 13327 (2023) Цитировать эту статью 1591 Доступ 2 Подробности об альтметрических метриках Микроскопия с локализацией одиночной молекулы обеспечивает разрешение почти до

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 13327 (2023) Цитировать эту статью

1591 Доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Микроскопия локализации одиночных молекул обеспечивает разрешение почти до молекулярного уровня со специфической молекулярной маркировкой и, таким образом, является многообещающим инструментом структурной биологии. Однако на практике реальная ценность этого поля ограничена, прежде всего, неполным флуоресцентным мечением структуры. Эта недостающая информация может быть восполнена путем объединения информации от многих структурно идентичных частиц с помощью подхода слияния частиц, аналогичного крио-ЭМ анализу одной частицы. В этой статье мы представляем анализ данных результатов слияния частиц флуоресцентно меченных нуклеопоринов Nup96 в комплексе ядерных пор, чтобы показать, что Nup96 встречается в пространственном расположении двух колец по 8 единиц с двумя копиями Nup96 на единицу, что в общей сложности дает 32 Nup96. копий на пору. Мы используем моделирование с помощью искусственного интеллекта в Alphafold, чтобы расширить существующую крио-ЭМ-модель Nup96, чтобы точно определить положение флуоресцентных меток и показать, что точность соответствия между флуоресцентными и крио-ЭМ данными лучше, чем 3 нм в плоскости. и выход из плоскости на 5 нм.

Комплекс ядерных пор (NPC) представляет собой важную молекулярную машину, встроенную в ядерную оболочку, соединяющую ядро ​​с цитоплазмой1,2,3. NPC действует как диффузионный барьер, который отделяет ядерный компартмент от цитоплазмы и служит воротами для регуляции генов4,5. Он незаменим в эукариотических клеточных процессах, таких как регуляция транспорта белков и рибонуклеопротеинов4,6,7. Структура и молекулярный состав NPC, в частности каркаса, тщательно изучены. Предыдущие исследования криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) и криоэлектронной томографии (крио-ЭТ) позволили определить структуру каркаса NPC с высоким разрешением1,2,3,8,9,10,11. Каркас состоит из множества копий примерно 34 различных нуклеопоринов (Nups), и эти Nups организованы в три кольца12,13,14. Предыдущие исследования показали, что цитоплазматическое кольцо (CR) и ядерное кольцо (NR) состоят из множества так называемых Y-комплексов и что белки Nup96 содержатся в этих Y-комплексах10,15. Каждое кольцо содержит 16 молекул Nup96, организованных в блоки с восьмикратной вращательной симметрией15,16,17.

Микроскопия сверхвысокого разрешения становится дополнительным методом изучения биологической структуры, поскольку она обеспечивает «неограниченное дифракцией» разрешение18,19,20. Микроскопия локализации одиночных молекул (SMLM) является одним из таких методов сверхразрешения и позволяет получать изображения сверхразрешения с разрешением 10–20 нм за счет локализации одиночных флуоресцентных излучателей18,21. Если можно отобразить множество химически идентичных структур, называемых частицами, их можно зарегистрировать и объединить в одну «суперчастицу». Благодаря этой стратегии зачастую плохая степень маркировки каждой отдельной частицы может быть смягчена и могут быть получены реконструкции с даже лучшим разрешением, чем типичные 20 нм22,23,24,25. Различные методы слияния частиц на основе двумерных шаблонов были применены в SMLM для демонстрации восьмикратной вращательной симметрии NPC22,26,27. Однако эти методы несут в себе риск создания реконструкций с уклоном в сторону шаблона. Позже подход к 2D-регистрации без шаблонов мог бы беспристрастно выявить восьмикратную симметрию NPC28. Этот метод без шаблонов был расширен до 3D и использован для реконструкции 3D-структуры Nup107 и Nup96, обнаруживающих два фазово-сдвинутых кольца с восемью каплями на кольцо29. Тем не менее, этот 3D-подход страдал от артефакта «горячей точки», который можно было смягчить только путем применения предварительных знаний о восьмикратной симметрии на этапе постобработки. В другом подходе к слиянию трехмерных частиц модель подгоняется к отдельным NPC30, и частицы объединяются в суперчастицу в порядке их сходства. Этот подход также показывает два кольца с восемью пятнами или кластерами в реконструкции NPC, как и ожидалось, но что интересно, некоторые из капель вытянуты и наклонены в плоскости колец. Ограниченные высокой вычислительной стоимостью, ни подход [29], ни подход [30] не могут реконструировать тысячи частиц за разумное время. Недавно мы представили подход без шаблонов и быстрого слияния частиц31, который преодолевает ограничение скорости вычислений, так что наборы данных из нескольких тысяч частиц (или более) теперь доступны для структурного анализа. В нашем итеративном подходе к быстрому слиянию частиц31 мы вращаем и перемещаем все частицы, чтобы они соответствовали модели гауссовских смесей (GMM), используя метод совместной регистрации множественных облаков точек (JRMPC)32, а затем обновляем положения и ширину гауссовских центров. На каждой итерации обновляются как частицы, так и GMM. Из-за присущих методу совместной регистрации32 ограничений мы можем получить только локально оптимальное выравнивание частиц, которые состоят из нескольких отдельных кластеров с разным положением. Затем мы классифицируем33 эти выровненные частицы с разными положениями и рекомбинируем их, чтобы получить глобально оптимальное решение, состоящее из одной хорошо выровненной структуры.